bioinformatics - ストランド特有のトップハット/カフスボタン

Question

組み立てるストランド固有の RNA-seq ライブラリがあります (イルミナ)。トップハット/カフスボタンを使いたいです。TopHat のマニュアルには、次のように書かれています。

「--library-type TopHat はリードをストランド固有として扱います。すべてのリード アラインメントには XS 属性タグがあります。正しい RNA-seq プロトコルを選択するには、以下のライブラリ タイプ オプションを指定することを検討してください。」

TopHat はストランド固有のプロトコルのみをサポートするということですか? オプション「--library-type fr-unstranded」を使用して実行していますが、それはストランド固有の方法で実行されるということですか? ググって開発者に聞いてみましたが、答えがありませんでした...

私はいくつかの結果を得ました：

ここで、コンティグは 2 つのグループの読み取りによって組み立てられます。左側はリバース リードで、右側はフォワード リードです。（視覚化のために、私は右のメイトを逆補しています）

しかし、一部のコンティグは、純粋に逆方向または順方向の読み取りから組み立てられます。鎖特異的である場合、1 つの遺伝子が同じ方向に読み取りを生成する必要があります。上の画像のような結果を報告するべきではありませんよね？それとも、1 つの遺伝子が断片化されてから独立して配列決定される可能性があるため、たまたま左側の部分がリバース リードを生成し、右側の部分がフォワード リードを生成する可能性はありますか? 私の理解では、鎖の特異性は 3'/5' ライゲーションによって保たれているので、遺伝子単位であるはずです。

ここで何が問題なのですか？または、「ストランド固有」の概念を間違って理解しましたか? どんな助けでも大歓迎です。

Answer 1

トランスクリプトームのde novoアセンブリを行いたい場合は、次のようなアセンブラ (マッパーではない) を調べる必要があります。

• 三位一体
• ソープデノボ
• オアシス....

Answer 2

Tophat/Cufflinks はアセンブリ用ではなく、既にアセンブリされたゲノムまたはトランスクリプトームへのアラインメント用です。読み取りを何に合わせていますか？また、ストランド固有のデータがある場合は、ストランド化されていないライブラリ タイプを選択しないでください。ライブラリの準備方法に基づいて、適切なものを選択する必要があります。アンストランド ライブラリ タイプを選択した場合、XS タグはスプリット リードにのみ配置されます。

Answer 3

Tophat は、孤立したライブラリと孤立したライブラリの両方を処理できます。スナップショットでは、中央領域に + と - の両方のストランド読み取りがあります。両端のバイアスは、ライブラリの準備または分析方法の特性である可能性があります。この遺伝子の向きは？少し左側に偏っているように見えます。左側が 3' 末端に対応する場合、ライブラリ プレップに 3' バイアス機能がある可能性があります (例: dT プライミング逆転写)。RNA を断片化する方法も、読み取り分布に影響を与える可能性があります。真実を見つけるにはもっと情報が必要だと思います。ただし、トップハット/カフスボタンにもバグがある可能性があることに注意してください。